Harris Albuquerque-ben, Új-Mexikóban született, és az új-mexikói Ruidosoban nőtt fel. Szülei, Sheila és Ron éttermet vezettek.[5] Az albuquerque-i La Cueva High Schoolba járt középiskolába, és igen aktívan részt vett az iskolai színjátszásban és musicalekben. Harris kitűnő tanuló volt, 1991-ben kitűnő eredménnyel végzett.
Harris gyerekszínészként kezdte karrierjét, Mark Medoff fedezte fel egy Las Cruces-i drámatáborban.[6] Medoff beválasztotta az 1988-as drámájába a Clara szívébe, amiben Whoopi Goldberg játszotta a főszerepet. Harrist a filmben nyújtott teljesítményéért Golden Globe-ra jelölték. 1988-ban főszerepet kapott az Emberevő bíborka című fantasyben. Egy évvel később ő kapta meg a Doogie Howser, M.D. címszerepét, amiért szintén Golden Globe-jelölést kapott. Miután a sorozat négy évad után 1993-ban véget ért, Harris sok sorozatban feltűnt vendégszereplőként, mielőtt 1995-ben megkapta első nagyobb felnőtt szerepét az Animal Room című filmben. Azóta a filmes karrierjében mellékszerepeket kapott a Második legjobb dolog, a Téglatesó és a Csillagközi invázió című filmekben. A Kalandférgek-vígjátékokban saját maga drogőrült, züllött változatát játssza.
1999-től 2000-ig Harris Tony Shalhoub mellett szerepelt a Stark Raving Mad című sitcomban, ami 22 epizódot élt meg. Sok csak TV-re gyártott filmben kapott főszerepet, köztük az 1994-es A hó fogságábanban, az 1995-ös Az első szerelemben, az 1998-as Karácsonyi kívánságban, az 1999-es Szent Johannában, a 2001-es Az esküvői ruhában és a 2005-ös The Christmas Blessingben, illetve sok sorozatban kapott vendégszerepet.
Neil dolgozott a Broadway-színházban is mind musical, mind drámai darabokban. Ő játszotta Tobias Ragget a Sweeny Todd 2001-es koncertelőadásában. 2002-ben Anne Heche mellett játszott az Egy bizonyítás körvonalaiban. 2003-ban Emcee szerepét vette át a Cabaret-ban Deborah Gibson és Tom Bosley mellett.
2004-ben az Assassins musicalben a Balladás és Lee Harvey Oswald szerepét is ő játszotta. Mark Cohent is megszemélyesítette már a Rent musical vándortársulatában, amely karaktert gúnyosan játszotta el újra a Saturday Night Live 2009. január 10-i adásában.
2005 ősze óta ő játssza Barney Stinsont, az Így jártam anyátokkal című szituációs komédiában. Ezért a szerepért 2007-től 2010-ig minden évben jelölték a legjobb férfi mellékszereplő Emmy-díjára.
2007-ben együtt dolgozott Michael J. Nelsonnal egy RiffTraxnak készülő audiókommentáron. A páros a Willy Wonka és a csokigyár című filmet figurázta ki. 2008-ban Harris megkapta a címszerepét Joss Whedon internetes musicalsorozatának, a Dr. Horrible's Sing-Along Blognak, amiben Nathan Fillion és Felicia Day játszották a másik két főszerepet. Az első rész 2008. július 15-én mutatkozott be,[7] amit a másik két epizód öt napon belül követett. 2009. április 26-án Harris volt a 7. TV Land Awards házigazdája.
Neil a Batman: A bátor és a vakmerő musical-epizódjában adta a hangját a gonosz Music Meisternek. Az epizód 2009. október 23-án került adásba az amerikai Cartoon Networkön.[8] Később, a Batman a piros sisak alatt című animációs filmben ő adta a hangját a felnőtt Dick Graysonnak (Éjszárny).
Harris szerepelt a Szép szörnyetegben[9] Alex Pettyfer és Vanessa Hudgens mellett, ahol is egy vak oktatót, Willt játszotta.
Az American Idol kilencedik évadjában vendég-zsűritag volt a 2009 augusztusi dallasi válogatáson.[10]
A Glee – Sztárok leszünk! "Álmodj tovább!" című epizódjában Bryan Ryan megformálásáért Emmy-díjat kapott.[11]
Harris nyíltan vállalja, hogy homoszexuális. 2006 novemberében erősítette meg a korábbi pletykákat: „... Örülök, hogy eloszlathatok minden kételyt és félreértést, és büszke vagyok, hogy kimondhatom, hogy egy nagyon elégedett meleg férfi vagyok...”.[12] A 2007-es Emmy-gálára párjával, David Burtkával érkezett. Később megerősítette kapcsolatukat, ami 2004-ben kezdődött egy interjú alkalmával a The Ellen DeGeneres Showban.[13] 2010. augusztus 14-én Harris bejelentette, hogy ikreket várnak egy béranyától.[14][15] Az ikrek, Gideon Scott egy fiú, és Harper Grace egy lány 2010. október 12-én születtek meg.[16][17]
Neil rajongója a bűvészetnek és maga is bűvész, csakúgy mint az Így jártam anyátokkalban a karaktere Barney. 2006-ban megnyerte a Tannen's Magic Louis Awardot, 2008. október 11-én pedig ő volt a házigazdája a 2008 World Magic Awardsnak. Harris az Emmy-díjas alakításában a Glee – Sztárok leszünk!-ben is varázsolt.